Marker sinh học mới (NS1) phát hiện sớm sốt xuất huyết Dengue

Marker sinh học mới (NS1) phát hiện sớm sốt xuất huyết Dengue

PGS.TS. Hà Hoàng Kiệm

1. Đại cương

1.1. Định nghĩa

Sốt xuất huyết Dengue là bệnh nhiễm khuẩn cấp do virus Dengue gây ra. Bệnh được lây truyền từ người sang người do muỗi Aedes, chủ yếu là A. aegypti còn gọi là muỗi vằn. Nước ta có 2 loại muỗi Aedes gây bệnh là Aedes aegypti và Aedes albopictus.

1.2. Biểu hiện lâm sàng

1.3. Vùng dịch tễ

Hình 1: Phân bố vùng sốt xuất huyết Dengue trên thế giới năm 2000.

2. Virus Dengue

2.1. Cấu trúc virus

Virus Dengue thuộc nhóm Flavivirus (họ Arbovirus nhóm B hay Flaviviridae), có cấu trúc hình khối đa diện đường kính 35-50 nm

- Nhân là 1 chuỗi ARN, bộ gene có khối lượng phân tử 11 kb, mã hóa cho 10 loại protein của virus gồm:

+ 3 loại protein cấu trúc là protein lõi C (Core), protein màng M (membrane), protein vỏ E (envolope).

+ 7 loại protein phi cấu trúc (non structure – NS) là NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5.

Virus Dengue có nhiều loại kháng nguyên, dựa vào sự khác biệt giữa các điểm quyết định kháng nguyên người ta chia virus Dengue ra làm 4 type huyết thanh là D1, D2, D3 và D4. Tuy vậy, các type của virus Dengue cũng có một số quyết định kháng nguyên chung nên chúng có hiện tượng ngưng kết chéo giữa các nhóm. Vì vậy kháng thể thu được sau khi nhiễm virus Dengue sẽ tạo ra miễn dịch bền vững với chính type virus đã nhiễm và miễn dịch chéo một phần với các typ virus còn lại (kéo dài khoảng 6 tháng).

2.2. Xét nghiệm phát hiện virus

- Xét nghiệm đặc hiệu:

+ Xét nghiệm phân lập virus bằng nuôi cấy

+ Xét nghiệm PCR Tìm RNA của virus Dengue trong máu

 Những xét nghiệm trên chỉ có thể thực hiện được ở các phòng xét nghiệm hiện đại và rất tốn kém.

- Xét nghiệm phát hiện nhanh và sớm:

+ Kháng nguyên Dengue NS1 (NS1-Ag)

+ Kháng thể Dengue IgM, IgG

Các xét nghiệm này giúp sàng lọc và hỗ trợ chẩn đoán sớm nhiễm virus Dengue.

2.3. Kháng nguyên Dengue NS1

- NS1 là 1 protein phi cấu trúc, có bản chất là glycoprotein, được tổng hợp ở cả dạng màng tế bào và dạng được bài tiết, là kháng nguyên kết hợp bổ thể, quyết định tính đặc hiệu nhóm và loài, có vai trò quan trọng trong phản ứng đáp ứng miễn dịch của cơ thể khi bị nhiễm virus.

Kháng nguyên NS1 (NS1-Ag) xuất hiện trong máu từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 9 của bệnh. Đáp ứng miễn dịch với kháng nhuyên NS1 tạo ra kháng thể IgM và IgG kháng virus Dengue.

- IgM được tìm thấy từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 5 của bệnh từ khi có triệu chứng và tồn tại khoảng 30 đến 60 ngày

- IgG xuất hiện vào ngày thứ 6 của bệnh, tăng nồng độ lên sau vài tuần, nhiều nhất ở tuần thứ 2 đến tuần thứ 3 và tồn tại suốt đời. Nhiễm virus thứ phát làm tăng IgG trong vòng 2 ngày sau khi có triệu chứng.

3. Test nhanh phát hiện sớm sốt xuất huyết Dengue

Test Dengue NS1 và test Dengue IgM, IgG cho phép chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời sốt xuất huyết Dengue. Tuy nhiên kháng thể Dengue IgM thường xuất hiện muộn vào ngày thứ 3-4 và Dengue IgG thường xuất hiện vào ngày thứ 14 sau khi nhiễm Dengue nguyên phát, nên việc chẩn đoán thường chậm; còn Real-time PCR để phát hiện Dengue RNA sớm nhưng chỉ có thể thực hiện được ở các phòng xét nghiệm hiện đại. Kháng nguyên Dengue NS1 (NS1 antigen) dương tính ngay từ ngày đầu của bệnh, vì vậy được cho là một dấu ấn sinh học mới (new biomarker) cho chẩn đoán sớm nhiễm virus Dengue. NS1 có thể phát hiện trước khi hình thành các kháng thể Dengue IgM và IgG. Kháng nguyên Dengue NS1 có thể phát hiện trong máu từ ngày đầu tiên cho đến ngày thứ 9 sau khi xuất hiện sốt, ở cả bệnh nhân nhiễm Dengue thể nguyên phát hoặc thứ phát, ngay cả khi Dengue-RNA còn âm tính và Dengue IgM còn chưa xuất hiện. Xét nghiệm kháng nguyên Dengue huyết thanh có độ nhạy 92,4% và có độ đặc hiệu là 98,4%.

- Test Dengue NS1- Ag là một thử nghiệm nhanh sắc ký miễn dịch dạng que dùng để định tính kháng nguyên NS1 của virus Dengue trong huyết tương hoặc huyết thanh của người bệnh. Ở Việt Nam đang sử dụng Dengue Ag Rapid Test của CTK Biotech (USA) với độ nhạy là 95.6% và độ đặc hiệu là 95.5%. Kết quả phải được đọc trong vòng 25 phút sau khi tiến hành, việc không tuân thủ theo qui trình hoặc đọc kết quả sau thời gian này có thể cho kết quả sai.

- Test Dengue IgM, IgG là một thử nghiệm nhanh sắc ký miễn dịch dạng que dùng để phát hiện và phân biệt đồng thời các kháng thể IgM, IgG kháng virus Dengue (D1, D2, D3 và D4) trong huyết tương hoặc huyết thanh của người bệnh. Ở Việt Nam đang sử dụng Dengue IgM/IgG Rapid Test của CTK Biotech (USA) với độ nhạy là 97,3% và độ đặc hiệu là 99,3%. Kết quả phải được đọc trong vòng 25 phút, việc không tuân thủ theo qui trình hoặc đọc kết quả sau thời gian này có thể cho kết quả sai. Kết quả có thể dương tính giả khi nhiễm các Flavivirus khác như Viêm não Nhật Bản, Sốt vàng, West Nile …, có thể âm tính giả khi số lượng kháng thể hiện diện trong mẫu dưới ngưỡng phát hiện của thử nghiệm hoặc kháng thể chưa xuất hiện trong giai đoạn lấy mẫu.

Hình 3: Độ nhạy của các xét nghiệm theo thời gian của bệnh sốt xuất huyết Dengue nguyên phát.

Hình 4: Độ nhạy của các xét nghiệm theo thời gian của bệnh sốt xuất huyết Dengue thứ phát.

Các kết quả xét nghiệm này chỉ nên được diễn giải khi kết hợp với các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng khác. Để chẩn đoán một cách đầy đủ các giai đoạn của nhiễm virus sốt Dengue, xét nghiệm kháng nguyên Dengue NS1 và các kháng thể Dengue IgM và IgG cần phải được chỉ định cùng với nhau.

Để phát hiện các type huyết thanh của virus Dengue, có thể chỉ định thêm xét nghiệm Dengue-RNA từ ngày đầu tiên đến ngày thứ 5 sau khi xuất hiện sốt.

Để đánh giá nguy cơ xuất huyết và tình trạng cô đặc máu, cần chỉ định thêm xét nghiệm tổng phân tích máu, trong đó cần chú ý đến số lượng bạch cầu, tiểu cầu và hematocrit.

Để đánh giá mức độ sốt xuất huyết Dengue, cũng cần chỉ định thêm một số xét nghiệm khác như điện giải đồ, khí máu, chức năng đông máu, enzym nguồn gốc gan hoặc X quang phổi.

4. Ý nghĩa lâm sàng

4.1. Từ ngày 1 đến ngày 5 sau khi xuất hiện sốt

Bảng 1. Ý nghĩa lâm sàng xủa các xét nghiệm từ ngày 1 đến ngày 5 sau khi xuất hiện sốt

Tất cả các xét nghiệm trên có tỷ lệ phát hiện nhiễm virus Dengue cao nhất ở ngày thứ 3 và ngày thứ 4. Tỷ lệ phát hiện các kháng thể Dengue IgM và IgG cao hơn kháng nguyên Dengue NS1 và Dengue PCR vào giữa ngày thứ 5 và ngày thứ 6 kể từ khi xuất hiện sốt.

4.2.Từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 9 sau khi xuất hiện sốt

Bảng 2. Ý nghĩa lâm sàng xủa các xét nghiệm từ ngày 9 sau khi xuất hiện sốt

4.3. Từ sau ngày thứ 9 sau khi xuất hiện sốt

Giá trị chẩn đoán của cả 3 loại xét nghiệm trên đều giảm một cách có ý nghĩa, chỉ còn (+) tính khoảng 0,8-1,6%, kể từ ngày thứ 9 sau khi xuất hiện sốt.

Bảng 3. Chỉ định và ý nghĩa của các xét nghiệm

5. Đối với xét nghiệm Tổng phân tích máu, trong sốt Dengue có thể có

- Giảm bạch cầu

- Thường có giảm số lượng tiểu cầu (< 100 G/L), số lượng tiểu cầu giảm tỷ lệ với nguy cơ xuất huyết

- Thường có sự cô đặc máu do thoát huyết tương, khi giá trị hematocrit tăng trên 20% so với giá trị trước đó hoặc tăng > 45% giá trị của người bình thường thì được coi là bị cô đặc máu.

6. Kỹ thuật sử dụng kít thử nhanh phát hiện kháng thể virus Dengue (IgG/IgM)

6.1. Khái quát

- Kít sử dụng là Onsite Dengue IgG/IgM Combo Rapid test

- Bệnh phẩm: Huyết tương, huyết thanh, máu toàn phần (tĩnh mạch hoặc mao mạch)

- Mục đích: Onsite Dengue IgG/IgM Combo Rapid test là kít thử nhanh dùng để phát hiện các kháng thể IgG/IgM kháng Dengue trong máu bệnh nhân. Đây là xét nghiệm rất tiện lợi và không cần đến các thiết bị xét nghiệm và đào tạo phức tạp.

Xét nghiệm huyết học phát hiện kháng thể kháng Dengue để chẩn đoán bệnh sốt xuất huyết Là phương pháp phổ biến. Kháng thể IgM xuất hiện 3 ngày sau khi lây nhiễm và có thể tồn tại 30-60 ngày. Kháng thể IgG tăng nhanh sau 7 ngày, đạt cao nhất sau 2-3 tuần và tồn tại suốt đời.

6.2. Nguyên lý hoạt động

Onsite Dengue IgG/IgM Combo Rapid test là dụng cụ xét nghiệm swacs ký miễn dịch theo nguyên lý dòng chảy một chiều bao gốm: 1) Vùng phức hợp được phủ sẵn phức hợp kháng nguyên Dengue (A2302, A2313) tái tổ hợp và IgG thỏ (Ag Dengue – IgG thỏ), 2) Vạch kết quả M được phủ sẵn kháng thể chuột kháng IgM người (Ab chuột kháng IgM người). Vạch kết quả G được phủ sẵn kháng thể chuột kháng IgG người (Ab chuột kháng IgG người). Vạch chứng C được phủ sẵn kháng thể dê kháng IgG thỏ (Ab dê kháng IgG thỏ).

Trong quá trình xét nghiệm, mẫu bệnh phẩm được nhỏ vào vùng nhận mẫu của test thử, bệnh phẩm sẽ di chuyển dọc theo test thử nhờ mao dẫn.

- Nếu có IgG kháng Dengue trong mẫu bệnh phẩm, IgG sẽ gặp và phản ứng với phức hợp kháng nguyên Dengue – IgG thỏ tại vùng phức hợp. Hóa hợp tạo thành tiếp tục di chuyển để gặp và phản ứng với kháng thể chuột kháng IgG người tại vùng kết quả G làm xuất hiện vạch màu đỏ tại đây, gọi là vạch kết quả G, thông báo kết quả là IgG Dengue dương tính.

Bước 1: IgG Dengue + Ag Dengue - IgG thỏ => IgG Dengue - Ag Dengue - IgG thỏ

Bước 2: Ab chuột + IgG Dengue - Ag Dengue - IgG thỏ => màu đỏ tại vạch G

Độ nhạy của xét nghiệm IgG 97,3%, độ đặc hiệu 99,3%, độ chính xác 99,1%.

- Nếu có IgM kháng Dengue trong mẫu bệnh phẩm, IgM sẽ gặp và phản ứng với phức hợp kháng nguyên Dengue – IgG thỏ tại vùng phức hợp. Hóa hợp tạo thành tiếp tục di chuyển để gặp và phản ứng với kháng thể chuột kháng IgM người tại vùng kết quả M làm xuất hiện vạch màu đỏ tại đây, gọi là vạch kết quả M, thông báo kết quả là IgM Dengue dương tính.

Bước 1: IgM Dengue + Ag Dengue - IgG thỏ => IgM Dengue - Ag Dengue - IgG thỏ

Bước 2: Ab chuột + IgM Dengue - Ag Dengue - IgG thỏ => màu đỏ tại vạch M

Độ nhạy của xét nghiệm IgM 96,9%, độ đặc đặc hiệu 98,9%, độ chính xác 98,7%.

- Nếu không xuất hiện vạch kết quả G hoặc/và vạch kết quả M, kết quả là âm tính, nghĩa là trong mẫu bệnh phẩm không có kháng thể IgG hoặc/và IgM.

- Vạch chứng: Nhằm mục dích kiểm tra quy trình thao tác xét nghiệm, một vạch màu luôn xuất hiện tại vùng chứng, gọi là vạch chứng, để thông báo rằng lượng mẫu đã đủ và lớp màng đã thấm tốt.

6.3. Cách lấy mẫu và bảo quản

- Huyết tương:

+ Lấy máu toàn phần tĩnh mạch vào ống nghiệm có chứa thuốc chống đông EDTA, citrate hoặc heparin.

+ Ly tâm để tách huyết tương.

+ Thu lấy huyết tương cho vào ống nghiệm khác đã ghi nhãn.

- Huyết thanh:

+ Lấy máu toàn phần tĩnh mạch vào ống nghiệm không có thuốc chống đông EDTA, citrate hoặc heparin.

+ Để cho máu đông cục lại.

+ Ly tâm để tách huyết thanh.

+ Thu lấy huyết thanh cho vào ống nghiệm khác đã ghi nhãn

Tiến hành xét nghệm sau khi lấy mẫu càng nhanh càng tốt. Nếu không thể xét nghiệm ngay, mẫu bệnh phẩm phải được bảo quản ở nhiệt độ từ 2-8⁰C với thời gian tối đa 5 ngày.

Để bảo quản lâu hơn, các mẫu bệnh phẩm phải được làm đóng băng và giữ ở nhiệt độ dưới -20⁰C. Mẫu chỉ được làm đông băng một lần, phải được để cho tan ra hoàn toàn và lắc đều trước khi làm xét nghiệm.

Các mẫu bệnh phẩm phải đảm bảo sạch, không sạn, không bị tan huyết hoặc lipid huyết, nếu không kết quả đọc có thể không chính xác.

- Máu toàn phần:

Mẫu máu toàn phần có thể lấy từ tĩnh mạch hoặc từ mao mạch đầu ngón tay. Không sử dụng mẫu máu đã bị tan huyết.

Có thể bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 2-8⁰C với thời gian tối đa 24 giờ.

6.4. Quy trình tiến hành xét nghiệm

Để các test thử, mẫu bệnh phẩm… ở nhiệt độ phòng (15-30⁰C). Nếu mẫu đã đông băng, để mẫu tan hoàn toàn và lắc đều trước khi làm xét nghiệm.

1) Lấy test thử ra khỏi túi đựng sản phẩm và sử dụng càng nhanh càng tốt.

2) Đặt test thử trên mặt phẳng khô và sạch.

3) Đánh dấu test thử tương ứng với mã bệnh nhân.

- Đối với các mẫu huyết thanh hoặc huyết tương:

Hút mẫu huyết thanh hoặc huyết tương bằng ống hút mao dẫn tới vạch lấy mẫu. Giữ ống theo phương thẳng đứng và truyền toàn bộ mẫu bệnh phẩm (khoảng 5μl) vào “ô nhận mẫu” của test thử. Tiếp tục nhỏ ngay 3 giọt dung dịch pha mẫu (khoảng 110-1305μl) vào “ô nhận dung dịch pha mẫu” và bắt đầu tính thời gian.

- Đối với mẫu máu toàn phần:

Hút máu toàn phần từ mao mạch (trực tiếp từ đầu ngón tay), tĩnh mạch (từ ống nghiệm) bằng ống hút mao dẫn tới vạch lấy mẫu. Giữ ống theo phương thẳng đứng và truyền toàn bộ mẫu bệnh phẩm (khoảng 5μl) vào “ô nhận mẫu” của test thử. Tiếp tục nhỏ ngay 3 giọt dung dịch pha mẫu (khoảng 110-1305μl) vào “ô nhận dung dịch pha mẫu” và bắt đầu tính thời gian.

4) Chờ cho đến khi các vạch đỏ xuất hiện trên test thử. Chỉ đọc kết quả trong vòng 25 phút. Kết quả dương tính có thể xuất hiện sau 1 phút. Không sử dụng kết quả sau 25 phút. Hủy test thử sau khi đã đọc kết quả.

Dương tính IgG: Xuất hiện hai vạch màu, một là vạch chứng C, một là vạch kết quả G. Thông báo trong mẫu bệnh phẩm chỉ có IgG kháng Dengue, chứng tỏ bệnh nhân đang bị nhiếm Dengue thứ phát sớm hoặc nhiễm Denguye nguyên phát muộn hoặc trước kia đã từng bị nhiễm Dengue.

Dương tính IgM: Xuất hiện hai vạch màu, một là vạch chứng C, một là vạch kết quả M. Thông báo trong mẫu bệnh phẩm chỉ có IgM kháng Dengue, chứng tỏ bệnh nhân mới bị nhiễm Dengue nguyên phát.

Dương tính IgG & IgM: Xuất hiện ba vạch màu, một là vạch chứng C, một là vạch kết quả G, một là vạch kết quả M. Thông báo trong mẫu bệnh phẩm có cả hai kháng thể IgG và IgM kháng Dengue, chứng tỏ bệnh nhân đang bị nhiễm Dengue nguyên phát muộn hoặc Dengue thứ phát sớm.

Lưu ý: Độ đậm của màu ở vạch kết quả (G, M) có thể khác nhau phụ thuộc vào nồng độ kháng thể IgG, IgM kháng Dengue trong mẫu bệnh phẩm. Vì vậy bất cứ độ mờ nào ở vạch kết quả (G, M) cũng đều được coi là dương tính. Mọi kết quả dương tính phải được khẳng định thêm bằng phương pháp khác.

Âm tính: Xuất hiện chỉ một vạch chứng C, không thấy xuất hiện vạch kết quả G hay M dù đậm hay mờ. Thông báo không có kháng thể kháng Dengue trong mẫu bệnh phẩm.

Kết quả không có giá trị: Không thấy xuất hiện vạch chứng C. Đọc lại hướng dẫn và làm lại xét nghiệm bằng test thử mới khác. Nếu như tình trạng vẫn như cũ có thể lô khay thử có lỗi không dùng được.

6.5. Hạn chế của kit thử

- Quy trình xét nghiệm và diễn giải kết quả phải được thực hiện nghiêm ngặt. Thực hiện sai quy trình có thể cho kết quả không chính xác.

- Kít thử Onsite Dengue IgG/IgM Combo Rapid Test là dụng cụ xét nghiệm định tính. Độ đậm của vạch kết quả không tương quan tuyến tính với nồng độ kháng thể trong mẫu bệnh phẩm.

- Thử Onsite Dengue IgG/IgM Combo Rapid Test không sử dụng để phân biệt lây nhiễm nào là sơ cấp hoặc thứ cấp. Kít thử không đưa ra bất cứ thông tin nào về loại huyết thanh Dengue.

- Phản ứng chéo huyết thanh với các họ virus khác là phổ biến (ví dụ viêm não nhật bản, virus tây sông Nile, sốt vàng da…). Vì thế, bệnh nhân bị lây nhiễm với các virus trên có thể cho kết quả phản ứng ở các mức khác nhau với kit thử này.

- Kết quả có thể âm tính giả khi nồng độ kháng thể khi nồng độ kháng thể kháng virus Dengue thấp hơn độ nhạy của kit thử hoặc kháng thể không có trong mẫu bệnh phẩm (trong một giai đoạn nhất định của bệnh). Vì vậy, kết quả âm tính không loại trừ khả năng phơi nhiễm hoặc lây nhiễm virus Dengue.

- Nếu kết quả âm tính mà triệu chứng lâm sàng vẫn còn, hãy lấy lại mẫu thử sau vài ngày hoặc cần thực hiện phương pháp xét nghiệm khác.

- Mẫu bệnh phẩm có nồng độ kháng thể khác có ái tính (heterophile) cao hoặc có yếu tố dạng thấp (RF) có thể ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm.

- Xét nghiệm này hoàn toàn có cơ sở trong việc chẩn đoán lây nhiễm sốt xuất huyết Dengue. Tuy nhiên kết luận cuối cùng phải do bác sĩ sau khi đã xem xét các kết quả xét nghiệm và biểu hiện lâm sàng khác.

Mời xem thêm bài:

Bài: "Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị sốt xuất huyết Dengue" trong  http://hahoangkiem.com/benh-truyen-nhiem/huong-dan-chan-doan-va-dieu-tri-sot-xuat-huyet-dengue-byt-2-2011-1567.html

Bài: "Nghiệm pháp dây thắt (Lacet), kỹ thuật và ý nghĩa lâm sàng" trong http://hahoangkiem.com/benh-truyen-nhiem/nghiem-phap-day-that-lacet-ky-thuat-va-y-nghia-lam-sang-1569.html

Tài liệu tham khảo

1. Cao Thành Vân - Khoa YHNĐ. http://bvdkquangnam.vn/tin-tc/y-hc-thng-thc/1700-st-xut-huyt-dengue-va-test-nhanh-phat-hin-khang-nguyen-khang-th-khang-st-xut-huyt-dengue.html

2. Quyết định số 458 /QĐ-BYT ngày 16 tháng 2 năm 2011 của Bộ trưởng Bộ Y tế

3. Nguyễn Nghiêm Luật - Bệnh viện MEDLATEC https://medlatec.vn/chi-tiet/can-lam-sang/khang-nguyen-dengue-ns1-mot-dau-an-sinh-hoc-moi-cho-chan-doan-som-sot-xuat-huyet-dengue-ngay-tu-ngay-dau-tien-sau-khi-xuat-hien-sot--4029-4029.aspx

4. Nguyễn Thị Thu Hương, Bệnh viện Đa khoa MEDLATEC. https://medlatec.vn/chi-tiet/can-lam-sang/chan-doan-sot-xuat-huyet-bang-xet-nghiem-dengue-ns1-5165-5165.aspx

5. CTK Biotech, Inc. Address: #10110 Mesa Rim Road, San Diego, CA 92121, USA. Công ty trách nhiệm hữu hạn AVANTA DIAGNOSTICS 286 đường Giải Phóng, phường Phương Liệt, quận Thanh Xuân, TP Hà Nội. Te +0436686821. Website: www.avanta.vn – Email: avanta.lienhe@gmail.com

CHIA SẺ BÀI VIẾT